所需材料：RiboCraft Alpha 转染试剂，RNA 储备溶液，无RNA酶水，无血清培养基或Opti-MEM™ 降血清培养基

1. mRNA转染实验

1.1  建议剂量和配置方法

在96孔板中进行 mRNA 转染实验时，建议的试剂用量如下：

•            V (H2O) = V(制剂体积) – V(mRNA储备液) – V (RiboCraft Alpha)

•            为确保移液准确，请准备足够体积的主混合液，至少能满足6个孔的需求。

•            以准备8复孔的用量为例，移液枪法混合样品：将 2.40 µL mRNA储备液（0.1 mg/mL）与 20.8 µL 无 RNase 水混合，用移液枪混合10次。然后加入 0.8 µL RiboCraft Alpha，用移液枪混合30次。让溶液在室温下静置 3 分钟。

•            可根据表格中推荐的范围优化配方中mRNA 剂量（ng/well）与RiboCraft Alpha 剂量（µL/well）。二者的比例无需固定在300: 1（mRNA 剂量: RiboCraft Alpha 剂量）。使用高剂量mRNA 时，可搭配低剂量的RiboCraft Alpha以节约试剂用量。

•            mRNA 储备溶液建议浓度：0.1 – 1 mg/mL；建议使用化学修饰的 mRNA（如5-甲基胞苷、假尿苷）。

•            不同培养体积的用量表推荐

该表使用量仅供参考，mRNA 与转染试剂具体使用量还需根据细胞类型及其他实验条件进行优化。

1.2  操作步骤

•            在转染实验前一天接种细胞。在转染实验当天，将细胞生长培养基更换为预热的无血清培养基或降血清培养基。悬浮细胞可以在转染前接种于无血清培养基中。(转染操作时，以细胞融合度达70% – 80%为佳，具体铺板密度根据细胞情况酌情而定)

•            96孔板规模实验，以准备8复孔的用量为例，振荡器法混合样品：

•           向一个1.5 mL的微离心管中加入20.8 μL 无RNase水。

•           在室温下向水中添加0.8 μL的RiboCraft Alpha，通过移液枪或涡旋振荡充分混合。

•           加入 2.4 µL mRNA 储备溶液（0.1 mg/mL），用移液枪混合5次。

•           将样品置于摇床上（900 rpm，25°C）摇动30秒, 必要时使用快速离心。

•           在室温下静置3分钟（纳米复合体通过快速自组装形成，并且在室温下可稳定30分钟）。

•           将转染复合物添加至细胞培养板每个孔中的无血清或降血清培养基里，摇板混匀。最终每孔mRNA剂量为 30 ng，总体积为100 μL。

•         在 37°C、5% CO₂ 的环境中孵育4 – 6小时。若需更长时间培养，可更换培养基或者补充完全培养基。
•         在适当的时间点（如4、18、24小时）评估mRNA转染效率和蛋白表达水平。

2. siRNA 转染实验
   1.  建议剂量和配置方法

在48孔板中进行siRNA 转染实验时，建议的试剂用量如下：

•            V (H2O) = V(制剂体积) – V(siRNA储备液) – V (RiboCraft Alpha)

•            为确保移液准确，请准备足够体积的主混合液，至少能满足6个孔的需求。

•            以准备6复孔的用量为例，移液枪法混合样品：将 3.0 µL siRNA储备液（10 µM）与 22.5 µL 无 RNase 水混合，用移液枪混合10次。然后加入 4.5 µL RiboCraft Alpha，用移液枪混合30次。让溶液在室温下静置 3 分钟。

•            可根据表格中推荐的范围优化配方中siRNA 剂量（pmol/well）与RiboCraft Alpha 剂量（µL/well）。二者的比例无需固定在20: 3（siRNA 剂量: RiboCraft Alpha 剂量）。使用高剂量siRNA 时，可搭配低剂量的RiboCraft Alpha以节约试剂用量。

•            siRNA 储备溶液建议浓度：10 – 100 µM

•            不同培养体积的用量表推荐

该表使用量仅供参考，siRNA 与转染试剂具体使用量还需根据细胞类型及其他实验条件进行优化。

2.2   操作步骤

•            在转染实验前一天接种细胞。在转染实验当天，将细胞生长培养基更换为预热的无血清培养基或降血清培养基。悬浮细胞可以在转染前接种于无血清培养基中。(转染操作时，以细胞融合度达70% – 80%为佳，具体铺板密度根据细胞情况酌情而定)

•            48孔板规模实验，以准备6复孔的用量为例，振荡器法混合样品：

•           向一个1.5 mL的微离心管中加入22.5 μL无RNase水。

•           在室温下向水中添加4.5 μL的RiboCraft Alpha，用移液枪混合5次。

•           加入3.0 μL的siRNA储备溶液（10 µM），用移液枪混合5次。

•           将样品置于摇床上（900 rpm，25°C）摇动30秒。

•           在室温下静置3分钟（纳米复合体通过快速自组装形成，并且在室温下可稳定30分钟）。

•           将5 μL转染复合物添加至细胞培养板每个孔中的无血清或降血清培养基里，摇板混匀。最终每孔siRNA剂量为 0.02 µM ，总体积为250 μL。

•            在 37°C、5% CO₂ 的环境中孵育4 – 6小时。若需更长时间培养，可更换培养基或者补充完全培养基。

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